腫瘤血管靶向肽

腫瘤細胞在遺傳上存在不穩定性，常常產生對多種化療藥物的耐藥性，是癌癥治療失敗的主要原因之一。在針對腫瘤的靶向肽篩選策略方面，雖然可以以腫瘤細胞為靶標，但是體外培養的腫瘤細胞常會丟失腫瘤組織的特異性分子或異常表達一些在相應腫瘤組織中并不存在的分子，增加了篩選的難度。與腫瘤細胞相反，腫瘤血管內皮細胞具有良好的遺傳穩定性，很少產生耐藥性，使腫瘤血管成為靶向肽篩選的理想目標。此外，對于靜脈途徑輸注的藥物來說，到達腫瘤血管也相對容易。基于基因組學和蛋白質組學的數據顯示，腫瘤組織或者其他器官的內皮細胞表達的分子受其原有的器官組織及其微環境決定，這是噬菌體展示技術篩選靶向肽的最重要的選擇性特點和先決條件。不同組織中血管獨特的分子標志在生理功能或疾病和腫瘤的發展中起到至關重要的作用。近年來篩選發現的腫瘤血管靶向肽見表5-1。

在上述眾多的血管靶向肽中，研究最多的就是RGD肽和NGR肽。RGD肽識別腫瘤血管內皮細胞髙表達的v3和v5整合素后，與整合素交聯，實現對腫瘤血管的靶向。整合素分子在正常細胞上僅有微量的表達，而在腫瘤細胞和腫瘤血管內皮細胞上呈現過表達的趨勢。NGR肽識別并結合到多種腫瘤血管內皮細胞中過度表達的氨肽酶N (也稱為CD13) 上，也具有較好的腫瘤選擇性。

在抗腫瘤研究中，血管靶向肽可以和藥物偶聯，實現藥物的主動靶向性。將RGD肽 (GSSSGRGDSPA)耦合至聚乙二醇(PEG)修飾的硬脂酸膠束后，過表達整合素的腫瘤對其攝取增加，從而使得膠束攜帶的藥物(阿霉素)更多地進入腫瘤細胞。另有研究通過用c(RGDyK),即環狀RGD肽，靶向遞送含有疏水性化療藥的膠束到達過度表達整合素的癌細胞。也有將NGR肽偶聯到鉑類抗癌藥物，以提髙腫瘤內的定位和結合的報道。 NGR和(或)STR-R4肽，附著于脂質體上PEG的末端，提高了 CD13陽性細胞對膠紙體的攝取。基于以上研究結果，RGD-環化五肽鹽西侖吉肽(EMD 121974，默克公司) 被用于非小細胞肺癌、神經膠質瘤、頭頸部癌和前列腺癌的治療中，下表列舉了幾項 RGD肽和NGR肽的臨床試驗(表5-2)。西侖吉肽在膠質母細胞瘤II期臨床試驗中可以使12%~15%的患者有長達六個月的無進展生存期。另有臨床研究通過RGD或 NGR肽連接TNF，得到NGR-hTNF，目前正在進行III期和III期臨床試驗，包含的癌腫有卵巢癌、肺癌、結腸癌和其他癌癥(表5-2)。使用NGR-hTNF的肝癌患者可以獲得8.9個月的中位生存率(平均為6個月)。

腫瘤細胞穿透肽

細胞穿透肽(cell-penetrating peptide，CPP)是指一類能夠穿透腫瘤細胞的肽段，一般 少于30個氨基酸，其中堿性氨基酸占多數。目前已提出了很多CPP的跨膜機制，主要包括三類：第一類是通過靜電作用直接滲透進入細胞膜。具體過程為未折疊的CPP首先與細胞膜表面通過靜電方式結合，直接跨過細胞膜，接著在分子伴侶的幫助下發生重折疊。 這是根據早期研究結果，認為CPP是非溫度依賴、非能量依賴、非受體依賴的非經典內吞方式的跨膜機制。第二種跨膜機制是通過形成某種跨膜結構發生轉導進入細胞。這類機制包括三種可能的模式:反轉微團模式、地毯模式和打孔模式。第三種跨膜機制是內吞作用介導入膜，這類機制是在發現CPP跨膜過程中涉及內吞作用后提出的。根據CPP有無靶向性，將其分成以TAT為代表性的非靶向穿透肽和以iRGD為代表性的靶向穿透肽(cell penetrating homing peptide, CPHP)。

(1)非靶向穿透肽:TAT蛋白轉導肽是人類免疫治療缺陷病毒1型(human immunodeficiency virustypel，HIV-1)編碼的一段富含堿性氨基酸、帶正電荷的多肽，屬于蛋白轉導域家族的一員。研究發現，其全長序列及11個堿性氨基酸富集區的核心肽段 (YGRKKRRQRRR)不僅能夠在包括蛋白質、多肽及核酸等多種外源生物大分子的跨膜轉導過程中具有重要作用，而且能夠攜帶這些外源生物大分子穿透活體細胞的各種生物膜性結構(細胞膜和血腦屏障等)進入胞內并發揮生理功能，但其跨膜轉導機制仍不十分明確。它具有穿透細胞的功能，但缺少腫瘤靶向性，有學者明，它和其他藥物(肽段或化療藥物)形成復合物后有協同效果。

(2)靶向肽與穿透肽偶聯：如果有些藥物與靶向肽偶聯合以后并沒有達到預想的抗腫瘤效果，可能原因是其內化效率較低。為了克服上述偶聯物的不足，有研究者將腫瘤耙向肽和穿透肽通過柔性氨基酸相連，形成靶向穿透雙功能肽如GRD-Tat、PEGA-pVEC、 gHo-pVEC等。將腫瘤靶向肽(TTP)和穿透肽偶聯，可以實現靶向性和穿透性的雙重功能;以這些肽作為載體形成的偶聯物特異性地將DNA、基因、化療藥物帶入腫瘤細胞內，從而達條滅腫瘤細胞的目的。腫瘤靶向肽和細胞穿透肽的偶聯模式見表 5-3。

(3)靶向穿透肽：2009 年，伯納姆醫學研究所癌癥研究中心的研究者們將焦點放在了一種同時具有靶向和穿膜功能的靶向穿透肽上。幾種靶向穿透肽見表5-4。

腫瘤血管生成過程中血管內皮細胞選擇性地大量表達整合素受體，早在1984年己經 確認含RGD (arginine-glycine-aspartic) 的序列肽段可以與腫瘤血管內皮細胞上的αvβ3受體結合。目前已經有研究表明，經RGD靶向肽修飾的納米載體苛以將藥物、siRNA、造影劑等投遞到腫瘤斑管處。然而，腫瘤血管靶向只是將藥物載體聚集于腫瘤血管內及其附近的組織，藥物載體如何跨學管壁，并有效地穿透到腫瘤實質仍然是目前腫瘤靶向治療的主要障礙。

2009年美國加州大學的學者通過一系列研究確認氨基酸C-端序列為R/KXXR/K的短肽是腫瘤組織內廣泛高表達的神經纖毛蛋白-1 (neuropilin-1，NRP-1)受體的特異性配體。 他們稱“氨基酸C-端序列為R/KXXR/K”的位點效應為C-端法則(CendR)。CendR序列 和NRP-1的相互作用是藥物克服生理屏障，促使其在組織內穿透的最關鍵因素。例如，血管內皮生長-165 (VEGF-165)的C-末端序列為R/K/XXR/K，因而其符合CenddR法 則，VEGF-165與NRP-1受體結合，促進了其血管穿透性。研究者經過深入研究發現，在既含腫瘤靶向血管肽RGD又符合CendR滲透法則的序列中，CRGDK/RGPDC環肽與腫瘤細胞的親和性最高，并能有效擴散入腫瘤組織和腫瘤細胞內，他們稱這種雙重功能的短肽為“iRGD”(internalizing RGD)，或稱腫瘤穿透肽(tumor penetrating peptide)。

腫瘤穿透肽iRGD是一個由9個氨基酸殘基組成的腫瘤特異性肽段，首先它具有血管相關肽RGD的功能，可與多種腫瘤細胞及腫瘤血管內皮細胞表面高表達的整合素受體特異性結合。與整合素受體結合以后，iRGD會被腫瘤組織中的蛋白酶降解為5個氨基酸殘 基(C-R-G-D-K/R),即C段為精氨酸(少數情況下為酪氨酸)，符合CendR法則，是腫瘤細胞特異性高表達的NRP-1受體的配體。由于NRP-1是調控藥物穿透進腫瘤組織和細胞的重要通路，所以經iRGD修飾的藥物靜脈給藥后，能首先通過iRGD靶向血管的功能使 其在腫瘤部位聚積，接著iRGD被酶解后出現的殘余肽端CRGDK/R與NRP-1受體結合， 會顯著提高藥物在腫瘤實質內的穿透能力，促進藥物分布到血管外的腫瘤細胞。

該團隊還構建了胃癌和卵巢癌腹膜播散模型，證明了iRGD腹腔給藥能夠靶向并穿透進入腹膜播散的腫瘤，并且比同樣劑量的藥物靜脈注射，具有明顯的優勢：腹腔途徑給藥時，藥物不僅可以進入含有大血管的腫瘤組織，還可以進入含有小血管的淋巴結。另外，將iRGD 4與小分子藥物共同腹腔給藥時，可以增加進入腫瘤內小分子藥物的濃度(右旋糖苷300%，阿霉素250%);將iRGD與納米粒子共同腹腔給藥，也可以促進納米粒子進入腫瘤。在腹膜播散模型中，iRGD聯合阿霉素多次給藥后，該組腫瘤的重量和淋巴結數目是最少的。

2012年針對有肝轉移或者肺轉移的進展期乳腺癌和前列腺癌的患者，City of Hope Medical Center 和 National Cancer Institute (NCI)組織了一項關于iRGD聯合磁共振造影 劑的I期臨床試驗。主要研究指標為磁共振造影劑單獨使用組和iRGD聯合磁共振造影劑組腫瘤體積轉移系數(Ktrans)的比較(時間框：基線至15天);次要研究指標為iRGD增強關鍵抗癌藥攝取的能力(時間框：15天)。但是本研究在入組前已被撤銷(原因未予公示)。2013年，該研究中心又根據iRGD序列，設計了內化NGR(intemalizing-NGR，iNGR， CRNGRGPDC)，其靶向腫瘤血管和滲透腫瘤組織的能力比NGR肽更加有效，另外它還可將偶聯的納米粒子帶入腫瘤內部，從而更好地發揮納米藥物的療效。