腫瘤靶向肽數(shù)據(jù)庫

腫瘤靶向肽既有來源于抗體CDRs的類型、模擬抗體和受體相互作用的類型，也有基于配體(EGFR、激素受體、整合素受體等)的腫瘤靶向肽。

Kapoor等構(gòu)建了一個(gè)基于腫瘤靶向肽的數(shù)據(jù)庫TumorHoPe，其網(wǎng)址為 http://crdd.osdd.net/raghava/tumorhope/。這個(gè)數(shù)據(jù)庫中的多肽可以特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞和腫 瘤相關(guān)的微環(huán)境(如新生血管)。網(wǎng)站中的信息來源于已發(fā)表的論文、專利和數(shù)據(jù)庫。 TumorHoPe的當(dāng)前版本包含744條肽。每個(gè)條目提供了肽的綜合信息，如序列、靶向的腫瘤、靶向的細(xì)胞、鑒定技術(shù)、肽受體等。此外，該網(wǎng)站還收錄了由肽的序列衍生出的其他各種信息，如肽的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)、氨基酸成分、肽的物理化學(xué)性質(zhì)。此數(shù)據(jù)庫包含針對(duì)多種腫瘤的靶向肽，包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌等;部分肽類具有一些共同的基序，如特異性識(shí)別腫瘤血管的RGD和NGR基序。TumorHoPe已經(jīng)集成了諸如搜索功能、數(shù)據(jù)庫瀏覽和肽繪圖等許多基于Web的工具。這些工具允許用戶基于氨基酸序列、電荷性、極性、疏水性來搜索腫瘤靶向肽(圖5-1) 。

噬菌體展示技術(shù)

噬菌體展示技術(shù)是一項(xiàng)特殊的基因重組表達(dá)技術(shù)，亦是一種強(qiáng)大的篩選技術(shù)，指將外源蛋白分子或多肽的基因克隆到絲狀噬菌體基因組中，與噬菌體外膜蛋白融合表達(dá)，然后展示在噬菌體顆粒的表面。由于外源蛋白或多肽的基因型和表型統(tǒng)一在同一噬菌體顆粒內(nèi)，因此，通過表型篩選就可以獲得它的編碼基因。

1990年，Scott等在噬菌體展示技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展并構(gòu)建了噬菌體展示隨機(jī)肽庫。噬菌體肽庫技術(shù)是一種新興的藥物發(fā)現(xiàn)工具，通過噬菌體展示隨機(jī)肽庫篩選獲得的肽可以作為子載體運(yùn)載藥物，起到生物導(dǎo)彈的功能。篩選的肽也可以直接與藥物靶點(diǎn)分子特異性結(jié)合，起到生物治療的作用。近年來，噬菌體肽庫技術(shù)已廣泛應(yīng)用于篩選腫瘤靶向短肽的研究中。

常用于噬菌體展示技術(shù)的噬菌體有兩種類型：M1線性噬菌體和T7噬菌體。噬菌體展示庫是把隨機(jī)短肽片段與噬菌體P3或基因的N端進(jìn)行融合，通過展示技術(shù)讓隨機(jī)短肽得以獨(dú)立表達(dá)并具有生物學(xué)功能。噬菌體肽庫構(gòu)建的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是得到足夠多的能獨(dú)立表達(dá)多肽的單克隆噬菌體，以便于靶標(biāo)的結(jié)合與識(shí)別。篩選的結(jié)果受多個(gè)因素的影響，而合理地應(yīng)用篩選方法是能得到高特異性、高親和力多肽的最重要的環(huán)節(jié)。

噬菌體展示文庫由數(shù)十億條肽組成，它可以在體內(nèi)鑒定組織的特異性從而研究疾病的特異性差異。將噬菌體展示文庫注射到小鼠體內(nèi)，進(jìn)入血液循環(huán)，表達(dá)有組織靶向肽的噬菌體會(huì)結(jié)合在靶組織上，然后從靶組織中提取噬菌體并通過感染合適的細(xì)菌宿主來進(jìn)行擴(kuò)增;將整個(gè)過程重復(fù)幾次以富集對(duì)靶組織具有高親和力的表達(dá)腫瘤靶向肽的特異性噬菌體(圖5-2)。此方法可以用于鑒定各種組織類型表達(dá)的分子標(biāo)簽、目前采用該技術(shù)已經(jīng)篩選到多種靶向特定組織(包括正常和癌性組織)的多肽。因?yàn)樾枰诙噍喼貜?fù)淘選中富集到有活性的噬菌體，該噬菌體展示圖譜的篩選可能相當(dāng)費(fèi)時(shí)。

合成肽庫

合成肽庫(synthetic peptide librarie, SPL)的方法也可以用于篩選及鑒定耙向肽。SPL方法允許篩選含有天然和非天然氨基酸的多種肽。它通過由含有4~10個(gè)氨基酸的短肽組成，這對(duì)于有效地選擇性傳遞送藥物最為適宜。通過分裂和混合方法能夠合成出數(shù)十萬數(shù)百萬的肽。

SPL是直接以氨基酸為原料，將其偶聯(lián)于某些載體或者是游離于溶液中的小肽的集合。根據(jù)最終的存在狀態(tài)將其分為固相SPL和液相肽庫，固相SPL的載體可以選擇聚苯乙烯珠、棉花、濾紙和聚乙二醇等。

mRNA展示技術(shù)

2012年Nature Communication 雜志上報(bào)道了采用mRNA展示技術(shù)篩選腫瘤穿透肽的方法。現(xiàn)以此文獻(xiàn)為例，做簡單介紹，如圖5-3所示。在體外將DNA文庫轉(zhuǎn)錄成RNA文序，把RNA的3'端和帶有嘌呤霉素的連接子結(jié)合使之與 RNA文庫在無細(xì)胞翻譯體系中共翻譯，隨后可以得到一個(gè)含有嘌呤霉素錨定的隨機(jī)化肽-mRNA-cDNA嵌合分子文庫。將Jurkat、CHO成HeLa等腫瘤細(xì)胞與該展示文庫溶液的培養(yǎng)基共孵育1小時(shí)。采用ELISA、磁珠法等，分離含有目標(biāo)肽的肽-mRNA-cDNA嵌合分子，洗脫后加酶分解到cDNA，將其進(jìn)行PCR，得到產(chǎn)物進(jìn)入下一輪循環(huán)，經(jīng)過多次循環(huán)，目標(biāo)肽及其編碼的基因序列最終得到富集和分離，部分氨基酸序列被鑒定為CPP的主要候選物。將得到的具有15個(gè)氨基酸的長度的CPP 與異硫氰酸熒光素(FITC)結(jié)合，采用Jurkat、CHO和HeLa細(xì)胞驗(yàn)證肽的功能。基于該項(xiàng)研究，作者通過嘗試不同細(xì)胞起源的惡性腫瘤系，篩選和鑒定了 47條具有對(duì)人腫瘤免疫治療細(xì)胞具有獨(dú)特穿透性的CPP。

軟件模擬

Sharma等利用TumorHPD網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器分析了大量的腫瘤靶向肽和非腫瘤靶向肽的數(shù)據(jù)，在初步分析這些數(shù)據(jù)時(shí)，研究者觀察到某些殘基存在于腫瘤靶向肽中的比例高于其他殘基，并且在特定位置存在“優(yōu)選氨基酸”如C、R、G、W、P、L和S在TTP中更豐富。為了理解N末端和C末端殘基的偏好，研壽考們計(jì)算并比較了 TTP和非TTP的 N-末端和C-末端殘基的氨基酸組成(AAC)百分比。然而，在末端殘基中沒有發(fā)現(xiàn)氨基酸組成的任何顯著性差異。另外在特定位置,存在某些優(yōu)選殘基，如在N末端第一位置的 C、A、S、G;在N末端第二位置的G、R、P、E等。類似地，在C末端P、R、C、N和 S等是優(yōu)選殘基。

基于這些觀察，研究者開發(fā)了軟件來區(qū)分腫瘤靶向肽和非腫瘤靶向肽的模型，并已經(jīng)開發(fā)使用了氨基酸組成(AAC),二肽組成(DPC)和二元圖譜(BPP)等SVM模型。由于二元圖譜法含有關(guān)于氨基酸順序及氨基酸出現(xiàn)頻率的信息，該方法在判斷腫瘤靶向肽方面相比于其他方法而言更具優(yōu)勢。基于上述方法，研究者已經(jīng)開發(fā)了 TumorHPD在線服務(wù)， 網(wǎng)址為：http://crddosdd.net/raghava/tumorhpd/，TumorHPD 是用于預(yù)測腫瘤耙向肽的第一 種計(jì)算機(jī)模擬方法。

另外有一套依據(jù)著名的熱點(diǎn)理論實(shí)現(xiàn)的靶向肽設(shè)計(jì)方法，其僅需要支架片段文庫和一些關(guān)鍵的錨定殘基就可以設(shè)計(jì)靶向多種蛋白的肽配體。

以hPD-1為例介紹該靶向肽的設(shè)計(jì)方法。關(guān)鍵錨點(diǎn)hPD-L1 [蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)代 碼：4ZQK]的殘基為 Y56、R113、A121、D122 和 Y123,這五個(gè)殘基對(duì) hPD-L1 與 hPD-1 的結(jié)合具有很大的影響。支架片段文庫由109 805個(gè)螺旋和123 230個(gè)鏈片段組成。受到五個(gè)錨的位置和支架片段的結(jié)構(gòu)特征的限制，研究者從支架文庫中選擇31個(gè)鏈和56個(gè)螺旋以承載錨A121、D122、Y123、Y56和R113的組合，形成513對(duì)支架對(duì)。513對(duì)支架對(duì)隨后被重塑和精制為連續(xù)肽，選擇其中4個(gè)肽并化學(xué)合成用于后續(xù)的生化驗(yàn)證。用基于SPR的方法檢測肽和hPD-1的結(jié)合親和力。四種肽的知值均不大于5umo1/L,最有效的 肽Ar5Y_4具有1.38±0.39umo1/L的KD值，表明這種方法能夠設(shè)計(jì)出具有理想親和力的肽配體。在四種肽中，肽Ar5Y_4具有最高結(jié)合親和力，代表它是最有效的hPD-1結(jié)合肽。后續(xù)研究驗(yàn)證了肽Ar5Y_4是有希望的hPD-1抑制劑，并且有待進(jìn)一步的優(yōu)化。